Entsyymisidottu immunosorbenttimääritys: dekoodaus, menetelmät

Liittyvien tieteiden, kuten genetiikan, molekyylibiologian, kemian, kehityksen sekä teknisen kehityksen kasvun myötä moderni lääketiede ylpeilee innovatiivisilla menetelmillä monenlaisten ihmisten sairauksien diagnosoimiseksi. Niille on ominaista korkea tulosten tarkkuus ja suorituskyvyn turvallisuus. Yksi näistä tavoista tunnistaa terveysongelmat on entsyymisidottu immunosorbenttimääritys. Se on saanut laajaa suosiota viimeisen vuosikymmenen aikana ja on saanut maineen erittäin tehokkaana, luotettavana ja potilaille turvallisena menetelmänä tautien havaitsemiseksi jo ennen ulkoisten oireiden puhkeamista. Selvitämme helposti, mikä tämäntyyppinen diagnoosi on, mikä on sen toiminnan periaate, huomaamme edut, suunnaamme tällaisen analyysin kustannuksiin.

Kehon reaktio patogeeniseen kasvistoon

Jotta ymmärretään, miten entsyymisidonnaisen immunosorbenttimäärityksen ansiosta laboratorioteknikot diagnosoivat erilaisia ​​sairauksia, on tarpeen ymmärtää fysiologinen prosessi, joka tapahtuu kehossa infektioiden aiheuttaman infektion aikana. Kun patogeeninen mikro-organismi saapuu verenkiertoon, ihmisen immuunijärjestelmässä tapahtuu suojaava reaktio tiettyjen aineiden - vasta-aineiden - vapautumisen muodossa. Ne sitoutuvat soluun ja analysoivat onko se osa vartaloa vai tunkeutunut ulkopuolelta. Jos immuunijärjestelmä toteaa, että solu on vieraita, vasta-aineiden määrä alkaa kasvaa patogeenisen mikro-organismin torjumiseksi.

Vasta-aineita on monissa muodoissa ja niillä on omat piirteensä. Jotkut aineet ilmestyvät suoraan tartuntakaudella, toiset pysyvät koko elinajan ihmiskehossa, ja heidän ansiostaan ​​ne kehittävät vakaan immuniteetin tiettyyn sairauteen. Proteiinirakenteet jaetaan seuraaviin tyyppeihin: A, D, E, M, G. Lääketieteessä vasta-aineita kutsutaan immunoglobulineiksi. Siksi on tapana nimetä näiden aineiden indikaattorit latinalaisin kirjaimin Ig.

Entsyymisidottu immunosorbenttimääritys (ELISA) perustuu lääketieteellisestä tiedosta saatuihin tietoihin. Käyttämällä laboratoriossa erityisiä antigeenejä on mahdollista määrittää tiettyjen vasta-aineiden esiintyminen tai puuttuminen biologisessa materiaalissa. Tällaisen analyysin tulosten perusteella lääkäri voi tehdä diagnoosin ja määrittää patologian esiintymisen lisäksi myös sen alkuperän rajoittamisen potilaan vaaratason tunnistamiseksi. Entsyymisidottu immunosorbenttimääritys tutkii useammin kuin muut ryhmien M ja G vasta-aineiden läsnäolon.

Mikä on IFA??

Itse asiassa entsyymisidottu immunosorboiva määritys ei ole innovaatio nyky-yhteiskunnassa. Se keksittiin takaisin 80-luvulla. Mutta tällaisten tutkimusten suorittamiseen vaadittiin tilaa vieviä kalliita laitteita. Siksi tätä menetelmää käytettiin vain erityisesti varustetuissa tieteellisissä laboratorioissa: sitä käytettiin solujen ja kudosten tyypittämiseen. Mutta sitten hän ei saanut laajaa jakelua diagnostisessa lääketieteessä, sen käyttö oli teknisesti vaikeaa ja erittäin kallista. ELISA parani vain tekniikan kehityksen ja biopolymeerimateriaalien keksimisen myötä. Sen jälkeen menetelmää alettiin popularisoida ja saada luottamusta lääketieteellisiin piireihin.

Kuten edellä mainittiin, tähän menetelmään sisältyy tiettyjen immunoglobuliiniryhmien havaitseminen biomateriaalissa - veressä, amnionivedessä, lasimaisessa tai aivo-selkäydinnesteessä -..

On tutkimuksia ilman antigeenin levittämistä pintaan ja entsyymisidottua immunosorbenttimääritystä, johon liittyy reaktio erityisissä kaivoissa. Jälkimmäisellä menetelmällä on suuri herkkyys ja luotettavuus, minkä vuoksi lääketieteellisissä laboratorioissa suoritetaan tällä tavalla analyysi ihmisen sairauksien havaitsemiseksi.

Entsyymiin kytketty immunosorbentti-määritys

Väitetystä sairaudesta riippuen entsyymiliittyneestä immunosorbenttimäärityssarjasta käytetään tarvittavaa antigeeniä, joka kemiallisen reaktion aikana tartunnan läsnä ollessa sitoutuu patogeeniseen kasvistoon. Tätä prosessia kutsutaan immuunivasteeksi..

Sitten, jotta voidaan visuaalisesti määrittää tutkimuksen tulos, suorita ELISA: n entsymaattinen vaihe. Tähän sisältyy materiaalin värjäys erityisillä reagensseilla. Tässä tutkimuksessa käytetään entsyymejä, kuten alkalista fosfataasia, peroksidaasia ja avidiinia. Kemiallisten reaktioiden aikana saadun värin mukaan entsyymi-immunomäärityksen tulos määritetään.

Mikä on kolorimetria??

Diagnoosin entsymaattisen vaiheen analyysi suoritetaan menetelmällä, jota kutsutaan "kolorimetriseksi". Tosiasia on, että materiaalin värin lisäksi ei anneta tietoa infektiosta, vaan myös kemiallisista reaktioista johtuvasta väritiheydestä. Juuri tämä indikaattori määrää patogeenisen mikro-organismin pitoisuuden. Jos manuaalista diagnostiikkamenetelmää käytetään vanhalla tavalla, näiden indikaattorien määrittämiseksi rakennetaan erityinen kalibrointikaavio.

Nykyaikaisissa laboratorioissa manuaalista menetelmää käytetään nykyään harvoin. ELISA-analyysiin käytetään erityistä laitetta - kolorimetriä, jossa vain tutkimusparametrit asetetaan manuaalisesti ja sitten kaikki työ, mukaan lukien piirtäminen, suoritetaan automaattisesti.

ELISA-menetelmät

Entsyymimmuunimäärityksessä on suoria ja epäsuoria menetelmiä. Ensimmäinen näkymä vie vähemmän aikaa, koska siinä on vain 3 suoritusvaihetta. Ensin lisätään spesifisiä vasta-aineita koemateriaalin antigeeneihin, jotka on sijoitettu erityisiin kaivoihin. Sitten niiden ylimääräinen määrä poistetaan ja analyysin entsymaattinen vaihe suoritetaan, jolloin saadaan tulos.

Epäsuoraa menetelmää käytetään paljon useammin, koska sen herkkyys on suurempi kuin suoraa diagnoosimenetelmää. Sitä suoritettaessa käytetään kaksoistutkimusta. Nimittäin, antigeeni liitetään ensin leimaamattomaan vasta-aineeseen ja sitten leimattuun vasta-aineeseen. Tämä prosessi vie enemmän aikaa, mutta tulos on tarkin..

Reagenssisarjat

Eri valmistajat tuottavat entsyymisidottuja immunosorbenttimäärityssarjoja monenlaisissa kokoonpanoissa. Venäjällä tunnustettu yritys on lääketieteen ja biologian liitto. Tämä valmistaja tuottaa reagenssipakkauksia ELISA-tutkimuksiin melkein kaikista leveysasteillamme yleisistä infektioista, jotka voidaan analysoida tällä tavalla. Itse reagenssien lisäksi sarjoihin sisältyy lisämateriaaleja, mikä varmistaa turvallisuuden, mukavuuden ja nopeuden analyysissä. Lisäksi kemialliset aineet on maalattu eri väreillä, mikä vähentää virheen todennäköisyyttä reagenssin laboratorioassistentin valinnassa.

Kemiallis-biologiset sarjat eroavat toisistaan ​​suhteellisen saatavuuden suhteen, mikä vaikuttaa suoraan entsyymi-immunomäärityksen jakautumiseen ja saatavuuteen väestölle.

Diagnostisen menetelmän edut

Entsyymimmuunimäärityksellä on epäilemättä useita etuja verrattuna muihin diagnostisiin menetelmiin:

  1. Sen avulla voit jopa määrittää patogeenisten organismien vähäisen läsnäolon, mikä osoittaa testin korkean herkkyyden..
  2. Kyky havaita sairaus varhaisimmissa vaiheissa, mikä lisää huomattavasti onnistuneen parantamisen mahdollisuutta.
  3. Biologisen materiaalin ottamisen yksinkertaisuus ja mukavuus. Tällainen analyysi suoritetaan sekä yksityisissä että valtion laboratorioissa. Tarvittaessa sairaanhoitaja voi ottaa materiaalin potilaalta kotona.
  4. Analyysi vaatii hyvin pienen määrän biomateriaalia.
  5. Nopea tulos. Nykyaikaisten lääketieteellisten laitteiden avulla voit suorittaa analyysejä päivän aikana.
  6. Kyky havaita piileviä oireettomia infektiomuotoja.
  7. Opintojen saavutettavuus.
  8. Tätä menetelmää käyttävät massatutkimukset ovat tarvittaessa mahdollisia..
  9. On mahdollista seurata sairauden etenemistä ja määrätyn hoidon tehokkuutta, koska on mahdollista tehdä ELISA-analyysi monta kertaa täysin turvallista potilaalle..
  10. Analyysin vaiheiden automatisointi, joka eliminoi inhimillisen tekijän ja lisää tulosten luotettavuutta.
  11. ELISA-reagensseja säilytetään pitkään - noin vuoden.
  12. Analyysi on mahdollista ympäristön lämpötilan vaihtelulla..

Ryhmän M immunoglobuliinit

Immuunijärjestelmä tuottaa ryhmän M vasta-aineita heti vieraan antigeenin havaitsemisen jälkeen. Siksi, jos entsyymi-immunomääritys päättyi tällaisten aineiden havaitsemiseen biomateriaalissa, niin tämä osoittaa sairauden etenemisen akuutin vaiheen, primaarisen infektion. Ryhmän M immunoglobuliinit voivat olla kehossa jopa kuukauden infektion tyypistä riippuen. Sitten heidän lukumäärä pienenee täydelliseksi katoamiseksi.

Ryhmän G immunoglobuliinit

Tyypin G proteiinirakenteet näyttävät korvaavan ryhmän M. immunoglobuliinit.Nämä aine tuottaa vakaata, useimmissa tapauksissa elinikäistä immuniteettia sairaudelle. IgG: n proteiinirakenteen määrittäminen testimateriaalissa osoittaa, että keho on aiemmin tavannut taudinaiheuttajan ja että sillä on suojaava reaktio uudel- leen infektiolta..

Diagnoosin indikaatiot

Entsyymisidottua immunosorbenttimääritystä käytetään määrittämään erilaisia ​​tartuntatauteja, hormonaalisia tiloja ja tehdään allergiatestejä. Nimittäin:

  • määrittää kilpirauhashormonien taso;
  • lisääntymishormoni-paneelin indikaattorit;
  • tuumorimarkerit;
  • havaita tartuntatautien patogeenit, kuten sytomegalovirus, hepatiitti, toksoplasma, vihurirokko, tuhkarokko, tuberkuloosi, klamydia, syfilis, mykoplasma, ureplasma, candida, giardia ja jopa HIV;
  • he diagnosoivat autoimmuunisairauksia. Erityisesti entsyymi-immunomääritystä käytetään usein kilpirauhashormonien tutkimiseen: TSH, TG, T3 ja T4.

Diagnostisten tarkoitusten lisäksi entsyymimääritysmenetelmää käytetään lääketieteellisessä tutkimuksessa.

Kuinka materiaali otetaan?

Useimmissa tapauksissa laskimoverinäytteitä suositellaan analysoitavaksi. Tutkimuksen materiaalin käsittelyn ja valmistelun jälkeen suoritetaan entsyymisidottu immunosorbentti-määritys seerumille tai plasmalle.

Hormonaalisen paneelin tutkiminen vaatii erityistä huomiota, koska tässä tapauksessa on erittäin tärkeää ottaa huomioon aineen saannin ominaisuudet. Esimerkiksi useimpien hormonien diagnosointi naisen lisääntymisjärjestelmässä edellyttää laskimoveren ottamista tietyinä kuukautiskierron päivinä. Ulkoiset tekijät vaikuttavat moniin muihin hormoneihin: kausivaihtelu, vuorokaudenaika, potilaan psykologinen tila ja paljon muuta. Jos ei oteta huomioon tiettyjä tekijöitä, voit saada väärän tuloksen, mikä johtaa taudin pahenemiseen tai väärin määrättyyn hoitoon.

Joissakin, usein monimutkaisemmissa tapauksissa analyysi voi vaatia aivo-selkäydinnestettä, lasimaista huumoria tai amnioottista nestettä raskaana olevalla naisella. Näiden biologisten materiaalien keräämismenetelmiin liittyy tietty riski, niillä on vasta-aiheita ja toipumisaika. Siksi tällainen entsyymisidottu immunosorboiva määritys tulisi suorittaa vain lääkärin todistuksen perusteella ja hänen ammatillisessa valvonnassaan. Salauksen purkaminen vaatii tässä tapauksessa erityistä lääketieteellistä tietämystä ja voi viedä jonkin aikaa.

Analyysin valmistelu

Entsyymisidottu immunosorbenttimääritys tulisi suorittaa noudattaen kaikkia suosituksia, koska ulkoiset tekijät vaikuttavat tutkimuksen tuloksiin. Esimerkiksi on tärkeää luovuttaa laskimoverta tyhjään mahaan aamulla (korkeintaan 11 tuntia). 2 viikkoa ennen väitettyä materiaalin saantia sinun on lopetettava lääkkeiden, etenkin hormonien, käyttö. Muutama päivä ennen tutkimusta sinun tulee pidättäytyä alkoholin ja rasvaisten ruokien käytöstä, ja sulje pois fyysinen aktiivisuus, huolet ja stressit..

Tulosten salaaminen

Entsyymiin sidotun immunosorbenttimäärityksen tulosten purkaminen vaatii erityistietoa yllä kuvattujen proteiinirakenteiden (vasta-aineiden) ominaisuuksista (IgG ja IgM). Tutkimuksen indikaattoreita analysoidaan näiden tietojen mukaisesti. Taulukossa kuvataan vaihtoehdot, jotka voidaan saada analyysin aikana:

Entsyymi-immunomääritys: kopio
Immunoglobuliinit MImmunoglobuliinit GVäitetty salauksen purku
negatiivisestinegatiivisestiKeho ei ole koskaan kokenut tätä infektiota. Sille ei ole patogeeniä tai vasta-aineita.
negatiivisestipositiivisestiKeho on kehittänyt vahvan immuniteetin tartunnalle..
positiivisestinegatiivisestiAkuutti tartunnan muoto.
positiivisestipositiivisestiTodennäköisesti primaarinfektio, mutta vaaditaan lisädiagnostiikkatestejä.

Analysoimalla esitettyä taulukkoa voidaan päätellä, että useimmissa tapauksissa tarvitaan lisätutkimuksia diagnoosin vahvistamiseksi. Entsyymisidottu immunosorbentti-analyysi yksin ei voi antaa tarkkaa vastausta. Normilla ei tässä tapauksessa ole selkeitä rajoja: Ryhmän G havaitut proteiinit osoittavat vain, että vartalo on aikaisemmin saanut tartunnan määritetyllä patogeenillä. Mutta sama tulos voi viitata akuutin vaiheen esiintymiseen - on tärkeää verrata monia tekijöitä ja indikaattoreita oikean diagnoosin tekemiseksi.

Riskitekijät

ELISA on 90% tarkka. Siitä huolimatta, on olemassa riskitekijöitä, jotka vaikuttavat diagnoosituloksen vääristymiseen: laitteiden toimintahäiriöt, virheellinen materiaalin kerääminen, varastointi ja kuljetus, muiden ulkoisten tekijöiden huomioiminen.

Diagnostiikkaa verensiirron, hemolyysin, kirurgisten toimenpiteiden, biopsian tai biologisen materiaalin puhkaisun jälkeen ei suositella - tämä voi myös vaikuttaa indikaattorien tuloksiin.

Analyysikustannukset

Diagnostisen tutkimuksen kustannuksilla on laaja valikoima ja se riippuu määritystyypistä ja määritettävästä antigeenistä, koska näiden tekijöiden perusteella lasketaan reagenssipakkausten kustannukset ja määritetään analyysin monimutkaisuus. Mutta useimmissa tapauksissa entsyymisidottu immunosorboiva määritys on saatavana monille potilaille. Sen hinta on alkaen 300 r. jopa 2000 r.

ELISA on edullinen, nopea ja erittäin tehokas menetelmä suuren sairauden luettelon diagnosoimiseen. Vain pätevä lääketieteen ammattilainen voi kuitenkin tulkita tulokset ja tehdä diagnoosin.

Entsyymin immunomääritys indikaattorien erittelyllä

Immuunijärjestelmät ja entsymaattiset reaktiot

Kuten nimestä voi päätellä, IFA-verikoe sisältää useita komponentteja, nimittäin immuuni- ja entsymaattisen reaktion.
Immuunireaktion avulla voit yhdistää soluelementit ja patogeenit, kun taas entsymaattisen reaktion avulla voit visualisoida ja arvioida edellisen reaktion tulosta.

Mieti kutakin reaktiota yksityiskohtaisemmin..

Mitä immuunivasteet ovat??

Immuuni ovat spesifisiä reaktioita, joiden avulla voit sitoutua antigeenin vasta-aineeseen ja luoda immuunikompleksin. Mitä tämä tarkoittaa? Ensinnäkin on välttämätöntä ymmärtää, että minkä tahansa solun pinta sisältää molekyylejä, jotka sisältävät tietoa solusta, joita kutsutaan antigeeneiksi ja jotka on jaettu:

Yksittäisillä antigeeneillä on tietyistä samankaltaisuuksista huolimatta monia eroja. Ne ovat läsnä yhdessä tietyssä organismissa, eivätkä ne toistu koskaan toisissa. Lajiantigeenejä löytyy erityyppisten elävien esineiden organismeista. Joten esimerkiksi apinoilla, hevosilla tai koirilla on omat, toisin kuin mikään antigeeni. Siksi immuunijärjestelmä käyttää tämän tyyppisiä antigeenejä tunnistamaan omia ja vieraita solujaan, mikä tosiasiassa on entsyymin immunomäärityksen perusta.

Kuinka antigeenit tunnistetaan? Kaikki on täällä tarpeeksi selvää. Yksinkertaisesti sanottuna, immuunisolu tarttuu soluun, joka on aiheuttanut sille “epäilyn”, ja vertaa sen antigeeniä kuvauksen mielessä. Jos epäilyttävän solun antigeeni vastaa sitä, immuunisolu "vapauttaa" sen ja jatkaa. Jos kuvaus on erilainen, organismin reaktio uhkaan on yksi - tuhoaminen. Lisäksi "vihollisen" tunnustaminen on tässä tapauksessa lähes 100%.

Sandwich-tyyppinen immunomääritys-immunomääritys

Kuva. 2. Immunomääritys "sandwich" -tyypin kaavamainen esitys. ATP on substraatin vasta-aine, ATd on detektiovasta-aine, AH on antigeeni, M on leima, joka on kovalenttisesti kytketty detektiovasta-aineeseen, P on substraatti, jolle substraatin vasta-aine adsorboituu.

Tässä immunomääritysmuunnelmassa (kuvio 2) käytetään paria vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä tutkitun antigeenin spatiaalisesti etäisille epitoopeille..

I. Substraattivasta-aineiden sorptio

96-kuoppaisen immunomäärityslevyn kuopissa 1 - 2 μg: n substraattivasta-aineet sorboidaan kuoppaa kohti 100 μl: ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Inkubointi suoritetaan 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja ravistetaan vaakasuoraan tabletin ravistelijaan. Sitoutumattomien antigeenimolekyylien pesu (2-kertainen) suoritetaan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisältää 0,1% Tween-20 (PBST).

II. Lukko

Epäspesifisten sitoutumiskohtien estämiseksi levykuopat täytetään PBST: llä ja inkuboidaan 10 - 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.

III. Antigeenin inkubaatio

50 μl testiliuosta tai antigeenin vakiolaimennoksia lisätään esiasorboidun vasta-ainelevyn kaivoihin. Antigeenilaimennokset tulisi valmistaa PBST: n perusteella, koska Tween-20 vähentää proteiinimolekyylien epäspesifistä sitoutumista toisiinsa ja tabletin pintaan. Sekä testiliuos että antigeenin standardilaimennokset lisätään pareittain (tai 3 toistoa) käyttämällä kahta (kolme) kaivoa kutakin proteiinilaimennusta kohden. Inkubointi suoritetaan huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan jatkuvasti sekoittaen. Pesu suoritetaan PBST-liuoksella 3 kertaa.

IV. Entsyymimerkitty vasta-aineinkubaatio

100 μl spesifisten vasta-aineiden liuosta, joka on konjugoitu entsyymimerkillä, lisätään levyn kaivoihin. Konjugoitujen vasta-aineiden optimaalinen konsentraatio on yleensä valmistajan ilmoittama (käytetään yleensä konsentraatiota 2 - 4 μg / ml). Inkubointi entsyymimerkkiä sisältävien vasta-aineiden kanssa suoritetaan 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja ravistetaan vaakatasossa olevalla ravistelijalla. Pesu suoritetaan PBST: llä 5-6 kertaa.

V. Entsymaattisen reaktion suorittaminen, jota seuraa värillisen tuotteen esiintyminen

100 μl substraattiliuosta lisätään kuoppiin ja inkuboidaan 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa jatkuvasti sekoittaen..

VI. Pysäytä entsymaattinen reaktio

Ennen optisen tiheyden mittaamista värireaktio pysäytetään käyttämällä 0,5 M H2NIIN4. Inkuboinnin jälkeen lisätään 50 μl 0,5 M rikkihapon liuosta kuoppiin RPD: n työliuoksen kanssa. Sen jälkeen voit heti alkaa mitata optista tiheyttä.

VII. Absorbanssimittaus

Värillisen tuotteen liuoksen optinen tiheys mitataan λ = 490 nm: llä tabletispektrofotometrillä.

painettu versio

Lisätietoja immunoglobulineista

Kaiken kaikkiaan ihmiskeho tuottaa viittä tunnettua vasta-aineluokkaa, jotka on nimetty Ig: ksi (joka tarkoittaa immunoglobuliineja) ja jotka kuuluvat luokkiin A, M, G, E ja D. Ne kaikki ovat erittäin tärkeitä ELISA-tulosten tulkinnassa. Tietysti on paljon enemmän komplekseja, eivätkä kaikki niistä ole vielä avoinna. Mutta erilaisten sairauksien diagnosoinnissa kolme ensimmäistä vasta-ainetyyppiä ovat arvokkaimpia. ELISA-verikokeessa käytetään mahdollisimman paljon tietoa: vasta-aineiden esiintymisen hetki veressä, niiden konsentraation muutos ajasta, katoamisajasta ja spesifisen vasta-aineen tyypistä riippuen.

Joten primaarisen, akuutin tarttuvan prosessin osallistujat ovat luokan M immunoglobuliineja, jotka osoittavat aina akuuttia vaihetta, jopa kun sairaus poistetaan kliinisesti. Tyypillinen esimerkki on akuutin virushepatiitin B tai C. anicteric muoto. Entsyymisidottu immunosorbenttimääritys hepatiitille osoittaa, että henkilöllä on akuutti hepatiitti, ja oireet, kuten hypochondria, suun kuivuminen, nivelkivut ja muut epäspesifiset oireet ymmärretään helposti.

Useiden viikkojen kuluttua nämä vasta-aineet havaitaan yhä häviävässä konsentraatiossa, mikä tuottaa luokan G immunoglobuliineja. Niitä havaitaan veressä kuukausia tai jopa vuosia, ja ne osoittavat joko toipumisen ja voivat sitten pysyä elinaikana muodostaen vahvan immuniteetin. Tämä osoittaa voimakkaan suojan taudinaiheuttajien antigeenejä vastaan. Joten tämän luokan vasta-aineet tekevät ihmisestä immuuni toistuvista pernaruton ja ruton tapauksista. Mutta joskus nämä vasta-aineet eivät häiritse antigeenien haitallisia vaikutuksia. Tässä tapauksessa voimme puhua kroonisen prosessin aktiivisuuden lisäämisestä.

IgE: n suhteen sillä on sovelluksia erilaisten loistartuntojen ja allergisten tilojen diagnosointiin, ja IgD suorittaa aputoiminnon: entsyymisidottu immunosorbenttimääritys antaa sinun käyttää sitä kattavassa diagnoosissa keuhkoastman ja autoimmuunisairauksien hoidossa. ELISA-analyysin tulkinta on tietysti paljon monimutkaisempaa, ja immunologit voivat kertoa paljon enemmän. Mitkä ovat merkit siitä, että potilas voi mennä itsenäisesti laboratorioon suorittamaan tutkimuksia?

Kuinka ELISA-analyysi tehdään?

Varustetuissa laboratorioissa ja lääketieteellisissä keskuksissa treponemalimääritys entsyymiimmunomäärityksellä voidaan suorittaa useilla menetelmillä, joita kutsutaan suoriksi ja epäsuoteiksi. Näiden reaktioiden perusta on kuitenkin yksi tapa, jonka avulla voit analysoida syfilistä ELISA-menetelmällä. Tämä testi suoritetaan tietyllä tavalla..

Laboratoriolääkärin lääkärillä on erityinen tabletti - paneeli, jossa on reikiä pyöreiden onkaloiden muodossa jopa sata. Konsentroidut syfilisantigeenit valmistetaan myös erityisesti määrityssarjoissa, jotka asetetaan ELISA-levyn kaivoihin. Sen jälkeen kun potilaan veri on otettu aamulla tyhjään vatsaan, seerumi erotetaan verestä ja asetetaan kaivoihin, joissa on antigeenejä. Antigeeni-vasta-aineen sitoutumisreaktio esiintyy kaivoissa.

Sifilis-ELISA perustuu ensimmäisen vaiheen immuuniyhdisteiden sitoutumisreaktioon ja konjugoituu erityisen entsyymimerkinnän kanssa, jota tarvitaan reaktion laadun lukemiseen. Tässä vaiheessa lisätään entsymaattisen peroksidaasin lisäksi kromogeenisiä väriaineita materiaalin värjäämiseksi reaktion lopputuloksesta riippuen.

Tabletin näyttämien värillisten reikien perusteella testi salataan. Eri ELISA-menetelmien sarjoihin liitetään värimaailmataulukoita, jotka määrittävät potilaan seerumin immunoglobuliinien ja vasta-aineiden määrän, määrän yksikkötilavuudessa.

Reaktion tuloksen arvioimiseksi käytetään myös erikoislaitteistoa - spektrofotometriä fotometrian määrittämiseen ja kaivoissa olevan materiaalin tiheyden arviointiin verrattuna kontrollinäytteisiin. Tiheyden perusteella saadaan tulos, joka on selvästi vahvistettu jokaiselle syfilis-aiheuttajalle normien ja patologian rajoissa.

yleistä tietoa

Entsyymisidottua immunosorbenttimääritystä voidaan käyttää hormonien, immunoglobuliinien, immunologisten kompleksien sekä useiden biologisesti aktiivisten aineiden pitoisuuden määrittämiseen. Tällaisen tutkimuksen materiaalina voit lahjoittaa verta, aivo-selkäydinnestettä, lasimaisen elimen sisältöä jne..

Entsyymisidottua immunosorbenttimääritystä on viime aikoina käytetty yhä enemmän monien etujen takia:

  • herkkyys yli 90 prosenttia;
  • säilyttämiseen tarvittavien ainesosien vakaa varastointi;
  • nopea ja helppo diagnosointi;
  • materiaalien vähimmäiskustannukset;
  • automatisoitu prosessi;
  • halpa.

Lisäksi ELISA antaa sinun tunnistaa infektiot, mukaan lukien hepatiitti, varhaisessa vaiheessa. Siksi sitä suositellaan joskus PCR-tutkimusten sijasta sekä raskauden aikana. Se ei kuitenkaan tee ilman haittoja. Tällaisten testien tulokset puhuvat vain kehon vasteesta taudinaiheuttajalle, mutta sitä ei määritetä. Useimmissa tapauksissa suositellaan ELISA: n ja PCR: n yhdistelmää..

IFA-testauksen avulla voit selvittää koko sarjan tulokset. Erityisesti määritetään kilpirauhashormonien normi, kasvainmarkerien läsnäolo ja joukko infektioita. Norma valitaan jokaiselle indikaattorille erikseen. Joten aikuisten kohdalla ELISA: n tulisi normaalisti näyttää TG-arvot 70 IU / ml, T4 välillä 64 - 146 nmol / L, T3 lasketaan määränä 1,8-2,8 nmol / L.

Raskautta suunniteltaessa tällainen testaus voidaan tehdä sukupuolihormonien määrittämiseksi. Erityisesti luteinisoiva. Sen arvot vaihtelevat jakson päivästä riippuen. Erityisesti enimmäisarvo, joka voidaan havaita, on 150 ja vähintään 1 mU / L.

Kun ELISA: ta käytetään sukupuolihormonin määrittämiseen miehillä, luku välillä 0,5 - 10 mU / L on normaali indikaattori. Jos tutkitaan kroonista gonadotropiinia, tulokset vaihtelevat sukupuolen mukaan. Erityisesti aikuisilla miehillä ja naisilla, joilla ei ole raskautta, indikaattorin tulisi olla 5 mU / ml. Jos testit tehdään raskauden aikana, tulokset voivat olla erilaisia, raskauskolmanneksesta riippuen, jopa kymmeniin tuhansiin yksiköihin.

Mikä on klamydia

PCR: ää, kuten ELISA: ta, käytetään laajasti nykyaikaisissa laboratorioissa sukupuolitautien diagnosoinnissa. Samaan aikaan lääkärit suosittelevat usein molempien testien suorittamista. Monet potilaat uskovat, että tämä on ylimääräinen rahanveto, mutta näillä testeillä on vakava ero, vaikka ensi silmäyksellä ne saattavat tuntua samanlaisilta. Psykologisten tutkimusmenetelmien luokitusta voidaan kuitenkin soveltaa jossain määrin.

PCR: n ja ELISA: n tuloksia käytetään usein raskauden aikana, kun on tarpeen sulkea pois klamydiaalinfektio. Usein tällainen positiivinen infektiotulos on vastaus miesten ja naisten kysymykseen "Miksi en voi tulla raskaaksi". Hedelmättömyysriskin lisäksi raskauden aikana esiintyvä klamydia aiheuttaa vauvan tartuntariskin.

Pääongelma tällaisen tartunnan diagnosoinnissa on oireeton kulku. Spesifiset vasta-aineet voidaan kuitenkin havaita kymmenen päivän kuluttua tartunnasta. Jos PCR-testi raskauden aikana osoittaa tällaisten patogeenien esiintymisen tai puuttumisen, ELISA kertoo sinulle, missä vaiheessa prosessi on nyt

Tällainen tutkimus on myös tärkeä hoidon tulosten arvioimiseksi.

Analyysin salauksen purku

Hepatiitin tai muun patogeenin analyysi ELISA-suorituskyvyssä herättää usein kysymyksiä. Erityisesti kuinka salauksen purku suoritetaan. Tällä hetkellä tulokset osoittavat yhden viidestä immunoglobuliinista: IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. Juuri ne erottuvat, koska muiden roolia ei ole selvitetty loppuun asti. Tutkimuksessa tärkeimmät ovat luokat A, M ja G.

Immunoglobuliini A on ensisijaisesti vastuussa limakalvojen suojaavista toiminnoista. Heidän läsnäolonsa tulos on negatiivinen, jos tauti tunnistetaan akuutissa muodossaan heti. Sellaisten suojaavien markkereiden esiintyminen tapahtuu yleensä kaksi viikkoa taudin puhkeamisen jälkeen. Joskus positiivinen tulos saavutetaan jopa myöhemmin.

Näiden vasta-aineiden päätehtävä on mikro-organismien havaitseminen ja tuhoaminen. Heidän lukumääränsä vähenee aina, jos tauti laantuu. Yleensä kahdeksan viikon kuluttua taudin alkamisesta positiivinen tulos puuttuu jälleen. Luokan A immunoglobuliinien havaitseminen myöhemmin voi viitata prosessiin, joka virtaa krooniseksi.

Tärkeimmät markkerit, joiden dekoodaaminen auttaa määrittämään patologian akuutin vaiheen, ovat luokkaan M kuuluvat immunoglobuliinit. Voit havaita ne veressä viisi päivää infektion jälkeen. Niiden viivästyminen veressä on noin kuusi viikkoa, minkä jälkeen heidän katoamisensa tapahtuu nopeasti.

Luokan G immunoglobuliinit vastaavat immuunijäämävaikutuksen muodostumisesta. Niitä alkaa havaita veressä noin kuukauden kuluttua tartunnasta. Jatkossa niiden määritelmää venytetään useita kuukausia. Usein voit tarkkailla heitä koko elämäsi. Sellaiset immunoglobuliinit muodostuvat suojareaktiona, joka eliminoi uudelleeninfektion. Esimerkiksi sellaisia ​​immunoglobuliineja muodostuu sellaisen ihmisen veressä, jolla oli lapsuudessa vesirokko ja joka sai vastaavasti immuniteetin elämän loppuun asti. Tietysti on muitakin infektioita, joiden palaaminen on mahdollista. Tässä tapauksessa analyysi havaitsee tämän ryhmän immunoglobuliinien uudelleenkasvun.

Immunoglobuliineja E käytetään havaitsemaan loiset kehossa. Ryhmään D kuuluva immunoglobuliini sijaitsee B-lymfosyyteissä ja sitä esiintyy joissakin määrin terveillä ihmisillä. Noin kymmenen vuoden ikäisinä he saavuttavat maksimiarvonsa. Tällaisen immunoglobuliinin määrä kasvaa raskauden aikana. Lisäksi sen esiintyminen tavallista suurempana määränä voi olla merkki keuhkoastmasta, immuunipuutostilasta.

Salauksen purkaminen

Vasta-aineet, ne ovat myös immunoglobuliineja, jaetaan viiteen luokkaan, mutta niistä määritetään yleensä vain kolme: M, G ja A, jotka kerääntyvät kehoon eri ajanjaksoina tartunnan jälkeen.

Immunoglobuliinit M ilmestyvät ensin, ne ovat IgM. Ne syntyvät 4-5 päivästä tartunnasta ja ovat veressä puolitoista kuukautta, jonka jälkeen ne katoavat. Jos ELISA osoittaa heidän läsnäolonsa, kyse on taudin akuutista jaksosta tai sen pahenemisesta.

Kolmesta neljään viikkoon ilmaantuu IgG, eli luokan G immunoglobuliineja, joita voi olla läsnä useita kuukausia tai jopa vuosia peräkkäin. Jos ELISA tehtiin kahdesti kahden viikon välein ja IgG: n määrä molemmissa näytteissä kasvoi, voidaan puhua tartunnasta tai sen uudelleeninfektiosta.

IgA, eli luokan A vasta-aineet havaitaan infektion pahenemisesta tai kuukauden kuluttua sen esiintymisestä kehossa. Suurin osa niistä kiertää limakalvoissamme ja vain viidesosa veressä. Ne katoavat vasta sen jälkeen, kun kaikki tartunta-aineet on tuhottu, ts. Vähintään kaksi viikkoa tartunnan jälkeen, enintään kahdeksan.

Jos parantamisen jälkeen ELISA-analyysi osoittaa niiden esiintymisen, tauti on siirtynyt krooniseen vaiheeseen.

Salauksen purkamisen yhteydessä on kiinnitettävä huomiota myös muodossa oleviin merkkeihin + ja -. Vain lääkäri voi tehdä täydellisen tuomion, mutta joitain kehon piirteitä voidaan arvioida seuraavien tietojen perusteella:

Vain lääkäri voi tehdä täydellisen tuomion, mutta joitain kehon piirteitä voidaan arvioida seuraavien tietojen perusteella:

  • Infektioiden puutteen osoittamiseksi indikaattoreiden yhdistelmällä, kuten JgM, JgG, JgA, on kaikkialla miinus;
  • JgM ja JgA osoittavat immuniteetin esiintymisen rokotteen tai infektion jälkeen merkillä miinusmerkki ja JgG plusmerkillä (JgG (+));
  • Seuraavat indikaattorit voivat kertoa akuutin infektion esiintymisestä: JgA (- / +), JgG (- / +) ja JgM (+);
  • Kroonisten infektioiden pahenemisvaiheessa lomakkeessa on seuraava merkintä: JgM, JgG ja JgA plussilla kaikkialla;
  • Kroonisissa infektioissa havaitaan seuraava kuva: JgG (+/-), JgM (-) ja JgA (+/-);
  • JgM (-) osoittaa palautumisen.

Usein suoritetaan myös tutkimus, kuten veren seerumin entsyymisidottu immunosorboiva määritys. Sitä tarvitaan kilpirauhashormonien tutkimiseen. Tällaisten hormonien indikaattorit, kuten tyroksiini, vapaa tyroksiini, trijodityroniini, vapaa trijodityroniini ja tyreoglobuliini, ovat tärkeitä.

Lisäksi sellainen tutkimus on hyödyllinen tarttuvien ja autoimmuunisairauksien diagnosoinnissa..

Moskovit testataan koronaviruksen suhteen uudella tavalla. Mitkä ovat ELISA-analyysin ominaisuudet?

Anatoly Minkin, Olga Nizhelskaya

Massaseulonta

Sergei Sobyanin kertoi, että koronaviruksen aiheuttamiin rajoituksiin olisi puututtava. Et voi poistaa niitä liian aikaisin, jotta infektioiden toinen aalto ei alkaisi, mutta asukkaiden pakottaminen pysymään pitkään itsenäistymisessä on myös mahdotonta.

Lopullisen päätöksen tekemiseksi sinun on ymmärrettävä, kuinka moni ihminen on ollut sairas ja jolla on kehittynyt koskemattomuus. Monille tartunta häviää ilman oireita, mutta he tartuttavat muita..

Kaupunki on jo tehnyt yli 1,3 miljoonaa PCR-testiä ja 100 tuhatta keuhkotestiä tietokoneella tehdyllä tomografisella skannauksella. Mutta tämä ei riitä. Perjantaista 15. toukokuuta muskoviittien testaus alkaa käyttää entsyymisidottuja immunosorbenttimäärityksiä. Muutaman päivän välein satunnaisesti valitaan noin 70 tuhatta kansalaista, jotka voivat luovuttaa verta.

Heidät hyväksytään 30 klinikalla. Kutsu analyysin lähettämiseen lähetetään tekstiviestinä tai sähköpostitse. Kutsu sisältää linkin, josta voit tehdä tapaamisen lääkärin kanssa. Automatisoidut analysaattorit testaavat koronaviruksen vasta-aineiden esiintymisen veressä. Toukokuun loppuun mennessä testien määrä ylittää 200 tuhatta päivässä..

Kerättyjen tietojen avulla ymmärretään, kuinka suuri osa muskoviiteista on jo sairastunut ja saanut immuniteetin, kuinka moni ihminen on saanut tartunnan, ja myös käy selväksi, mikä on tartunnan leviämisen dynamiikka. Kaikki testissä osallistujat tunnustavat immuunijärjestelmänsä. Mahdolliset tartunnan kantajat lähetetään sairaalaan ja itsenäisesti. Kaikista kyselyn tiedoista tulee perusta päätökselle käyttöön otetuista rajoituksista.

Mitä testi näyttää

Entsyymisidottu immunosorbenttimääritys on diagnostinen menetelmä, joka perustuu vasta-aineiden reaktioon. Kun virus pääsee kehoon, se alkaa tuottaa erityisiä proteiineja - antigeenejä. Immuunijärjestelmä reagoi muukalaisiin ja vapauttaa vasta-aineproteiineja (immunoglobuliineja). Heidän läsnäolo veressä antaa mahdollisuuden selvittää, onko henkilöllä ollut kosketusta virukseen.

Tietoja tästä "360" kertoi lääketieteiden tohtori, Moskovan epidemiologian ja mikrobiologian tutkimusinstituutin varajohtaja G. N. Gabrichevsky Rospotrebnadzor Evgeni Selkov..

”Voit määrittää, onko henkilö sairas vai onko se nyt akuutissa vaiheessa, proteiineille, jotka on havaittu: immunoglobuliini G -luokka tai immunoglobuliini M -luokka. M - tämä on akuutti vaihe, G - tarkoittaa, että henkilö on ollut viime aikoina sairas ja hänen immuniteettinsa on alkanut muodostua ”, hän selitti.

Asiantuntija totesi, että analyysi oli tarkka. Se on välttämätöntä, etenkin niissä tapauksissa, joissa kehoon joutunut patogeeni ei johda tautiin. Immuniteetti taistelee hänen kanssaan sisällä, mutta henkilö itse ei huomaa sitä. Tämä on erityisen tärkeää nyt, koronaviruksen tilanteessa, kun oireettomia kantajia on paljon..

”IFA näyttää, oliko tämä henkilö sairas vai ei. Onko hänellä immuniteettia vai ei. Ehkä hän oli sairas, kärsi helposti, ei huomannut. Toinen tärkeä kohta: nyt voit määrittää immuniteettitilan suuressa ihmisryhmässä. Jos heillä on vasta-aineita, voit olla rauhallinen ”, tiivisti Evgenia Selkova.

Miten IFA toimii?

Kun virus pääsee kehoon, immuunijärjestelmä tuottaa ensin luokan M immunoglobuliineja - niitä on erityisen paljon, ja ne kiirehtivät ensin tuhoamaan viruksen tuottamat antigeenit. Luokan G immunoglobuliinit ilmestyvät lopussa virusantigeenien jäännösten loppuun saattamiseksi, ja sitten ne pysyvät veressä estääkseen viruksen pääsyn kehoon toisen kerran..

Rokote toimii myös silloin, kun henkilölle annetaan viruksen heikentyneitä antigeenejä immuniteetin kehittämiseksi..

Asiantuntijat ottavat verta analyysiä varten selvittääkseen, onko henkilöllä immuniteetti. Se lisätään erityiseen ratkaisuun, jossa patogeeniantigeenit ovat jo sijainnissa, ja ne katsovat reaktiota. Jos sitä ei ole ollenkaan, henkilö ei ole vielä saanut tartuntaa. Jos reaktio on väkivaltainen, sitten taudinaiheuttaja oli kehossa tai se on edelleen. Kaikki riippuu immunoglobuliinin M tai G tyypistä.

Ifa-menetelmä miten

Oppitunnin tarkoitus. Opiskelijalle tutustuminen fluoresoivien vasta-aineiden menetelmän periaatteesta ja immunofluoresenssireaktion perustamistekniikasta sekä entsyymiin kytketyn immunosorbenttimäärityksen suorittamisen periaatteelle ja tekniikalle.

Laitteet ja materiaalit. Inaktivoidut brucella- ja salmonellaviljelmät, 96-prosenttinen etanoli, PBS (pH 7,2. 7,4), märkäkammio (Petri-astiat, eksikkaattori), luminesoivat seerumit brucellaa vastaan, salmonella, kanin immunoglobuliinit, positiivinen luomistaudin seerumi, valmis ELISA-esittelylääke, luminesenssimikroskooppi.

Näissä serologisissa reaktioissa käytetään fluorokromilla tai entsyymeillä leimattuja vasta-aineita (immuuniseerumeita), ja myöhemmin, erityisiä menetelmiä käyttämällä, kirjataan antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostuminen. Joissakin suoritusmuodoissa ELISA-entsyymimerkki viedään antigeeniin.

Fluoresoivien vasta-aineiden (MFA) menetelmä. Tämä monimutkainen menetelmä yhdistää serologisen reaktion, jossa antigeenin ja vasta-aineen spesifinen vuorovaikutus tapahtuu immuunikompleksin muodostumisen kanssa, ja mikroskooppisen tutkimuksen, jolla tämä kompleksi havaitaan.

Immunofluoresenssireaktiossa käytetään vasta-aineita, joihin fluorokromi on kiinnittynyt (fluoreseiini on useammin isotiosinaatti). Sellaisilla vasta-aineilla on kyky reagoida spesifisesti antigeenin kanssa ja fluorokromin ansiosta hehkuu ultraviolettisäteiden vaikutuksesta. Kun määritetään MFA, mikrobi-antigeeni kiinnitetään lasilevylle ja käsitellään luminoivilla vasta-aineilla. Sitten lääke pestään vedellä sitoutumattomilta vasta-aineilta ja katsotaan luminesenssimikroskoopilla. Jos vasta-aineet vastaavat spesifisesti tätä antigeeniä, niin ne muodostavat antigeenin kanssa vahvan kompleksin ja luminesenssimikroskopian avulla valmisteesta löytyy kirkkaita mikrobisoluja (kuva 70).

MFA: n etuna diagnostiikkamenetelmänä on, että sen avulla on mahdollista serologisesti tunnistaa mikro-organismi suoraan patologisessa materiaalissa kahden tai kolmen tunnin kuluessa ilman eristämistä puhtaassa viljelmässä (ekspressimenetelmä). Kuten muutkin serologiset reaktiot, myös MFA: ta käytetään vasta-aineiden havaitsemiseen eläimen veressä..

Lääkkeen valmistus MFA: ta varten. Jos tartunta-aine (antigeeni) havaitaan lasilevyllä, valmistetaan sormenjäljet ​​elimistä tai muusta aineesta. Vasta-aineiden havaitsemiseksi koeveren seerumissa valmistetaan leikkejä tunnetusta antigeenistä, esimerkiksi salmonelloosin, pernaruton jne. Aiheuttavasta aineesta, lasille. Valmiste levitetyllä aineella (bakteerisuspensio, leivänjälki) kuivataan ilmassa ja kiinnitetään asetonilla (5 min), tai etanoli (10,15 min) tai metanoli (5,10 min). Lääke voidaan myös kiinnittää kuumentamalla, kuten tavallisella valomikroskopialla. Elinten ja kudosten pintajäljet ​​käsitellään parhaiten asetonilla, joka on jäähdytetty -20 ° C: seen. 4 min. Erityisistä tehtävistä riippuen valmiin valmisteen värjääminen luminoivilla seerumeilla suoritetaan eri tavoin.

Suora MFA. Kehittänyt Coons et ai. (1950). Pisara luminesoivia immuuniseerumeita työskentelylaimennokseen, joka sisältää vasta-aineita haluttua antigeeniä vastaan, levitetään lasilevylle, jolla on kiinteä antigeeni. Kuivumisen välttämiseksi valmiste asetetaan kosteaan kammioon (Petri-malja) vedellä kostutetulla suodatinpaperilla ja pidetään termostaatissa lämpötilassa 37 ° C. 38 ° C. 30 min. Sitten lääke 5. 10 minuuttia pestiin sitoutumattomista immunoglobulineista juoksevalla (vesijohtovedellä), jonka pH oli vähintään 7,0. Pesty valmiste kuivataan suodatinpaperilla ja mikroskooppisella..

Suorat MFA: t käytetään vain tuntemattoman antigeenin tunnistamiseen; sen haittana on tarve valmistaa luminesoiva seerumi jokaiselle tunnistettavalle mikro-organismille.

Epäsuora MFA.Sovellettu kahtena versiona.

Weller ja Coons (1954) ehdottivat kaksivaiheisia MFA-sopimuksia. Tätä vaihtoehtoa pidetään universaalisempana, koska yhden luminesoivan lajin vastaisen seerumin avulla voidaan havaita erityyppisiä mikro-organismeja..

Pisara leimaamatonta immuuniseerumia (ensimmäisen vaiheen seerumi) levitetään antigeenille. Valmistetta pidetään termostaatissa 15. 30 minuuttia, sitten se pestään immuuniseerumin sitoutumattomien vasta-aineiden poistamiseksi ja kuivataan (katso suora vaihtoehto). Jos ensimmäisen vaiheen seerumin vasta-aineet vastaavat antigeeniä, niin vesi ei pese muodostunutta AG-AT-kompleksia (vasta-aineet kiinnittyvät antigeeniin).

Pisara luminesoivia lajien vastaisia ​​seerumeja (toisen vaiheen seerumi) työtiitterissä laitetaan kuivattuun valmisteeseen. Lääke asetetaan uudelleen termostaattiin märään kammioon 15.30 minuutiksi, pestään sitten vedellä ja kuivataan. Lajien vastainen seerumi on fluorokromilla leimattu vasta-aine sellaisten lajien eläimen veren immunoglobuliineja vastaan, joista ensimmäisen vaiheen immuuniseerumi saatiin. Siten ensimmäisen seerumin vasta-aineet toimivat antigeeninä lajien vastaisten seerumien leimattuihin vasta-aineisiin. Seurauksena on, että toisen vaiheen vasta-aineet kiinnittyvät ensimmäisessä vaiheessa muodostuvaan AG-AT-kompleksiin ja muodostuu kaksinkertainen kompleksi, joka voidaan havaita luminesenssimikroskoopilla.

Epäsuoran vaihtoehdon monipuolisuus johtuu siitä, että ensimmäisessä vaiheessa käyttämällä samojen lajien eläimistä (esimerkiksi hevosista) saatuja immuuniseerumeita erilaisille mikro-organismeille, toisessa vaiheessa yhden lajin vastaisen seerumin avulla voidaan tunnistaa rajaton määrä tartuntatautien patogeenejä..

Kolmivaiheinen MFA on variantti DSC: stä lasilla. Tässä tapauksessa lasilla olevassa immuunikompleksissa luminesenssiseerumin avulla havaitaan liittyvä komplementti (kuva 71).

Käyttämällä kaksivaiheista tai kolmivaiheista MFA: ta ja käyttämällä tunnettua antigeeniä, vasta-aineet voidaan havaita eläinten veressä.

Ohjauksia tarvitaan MFA-tulosten tarkkuuden varmistamiseksi. Suoralle variantille riittää yksi kontrolli: homologisia ja heterologisia antigeenisesti mikro-organismeja käsitellään luminoivalla seerumilla. Ensimmäisessä tapauksessa bakteerit hehkuvat, toisessa hehkua ei ole.

Epäsuoraa vaihtoehtoa varten asetetaan kaksi kontrollia: 1) homologisia ja antigeenisesti heterologisia mikro-organismeja sisältäviä tahroja käsitellään lajien vastaisilla luminoivilla seerumeilla. Jos ensimmäisen vaiheen vasta-aineita ei ole, solujen ei tulisi luminesoida; 2) homologisten ja heterologisten antigeenisesti esiintyvien bakteerien määriä käsitellään immuunijärjestelmällä (antimikrobinen) seerumilla (ensimmäinen vaihe), jota seuraa fluoresoivan antiglobuliinin (lajien vastaiset) seerumin levittäminen (toinen vaihe). Ensimmäisessä tapauksessa havaitaan erityinen bakteerien hehku, toisessa se puuttuu.

Makrotaloudellisen rahoitusavun tulosten arviointi. Ota huomioon hehkuuden kirkkaus, väri, sijainti ja rakenne. Bakteereissa, jotka on värjätty (käsitelty) fluoreseiini-isosyanaatilla merkityllä luminoivalla seerumilla, solun reunalla havaitaan yleensä kirkkaan vihreä hehku vanteen tai halogeenin muodossa, bakteerien keskiosa hehkuu heikosti. Tällainen luminesenssi selitetään sillä, että mikrobisolun kehällä olevalta yksikköalueelta projisoidaan useita kertoja enemmän vasta-aineita tarkkailijan silmän verkkokalvolle kuin sen keskiosasta. On muistettava, että muovisissa bakteereissa (leptospira, vibrios) koko solu hehkuu. Kudosnesteeseen upotetuissa soluissa ja nuorissa pernaruttobakteereissa ääriviivat eivät yleensä ole äänekäs.

Hehkun intensiteetti arvioidaan nelijärjestelmällä: 1) (++++) - erittäin kirkas fluoresenssi mikrobisolun kehällä, selkeästi kontrastina solun tumman keskiosan kanssa; 2) (+++) - solun reunan kirkas fluoresenssi; 3) (++) - heikko hehku solun reunalla; 4) (+) - mikrobisolun reunan ja keskusosan kontrastihehkua ei ole. Spesifisen hehkun puuttuminen osoitetaan miinusmerkillä (mikro-organismien varjot ovat näkyviä). Sairauksien erilaisten patogeenien diagnosoinnissa bakteerisolujen spesifisen hehkuvuuden katsotaan olevan positiivinen tulos, vähintään neljä tai kolme ristiä.

Entsyymiin kytketty immunosorbenttimääritys (ELISA). Tämä menetelmä sai jakelua sen jälkeen, kun entsyymimerkinnän lisääminen vasta-aineiden tai antigeenien molekyyleihin oli ratkaistu. Entsyymiin liittyvät vasta-aineet säilyttävät kyvyn reagoida spesifisesti homologisen antigeenin kanssa, ja entsyymi on vuorovaikutuksessa vastaavan substraatin kanssa.

ELISA: ta käytetään yleensä histokemiallisissa (immunoperoksidaasireaktio) ja kiinteäfaasimuunnoksissa.

Histokemiallinen ELISA. Tätä menetelmää käytettäessä mikrobi-antigeenejä löytyy yleensä sormenjälkivaahdoista, verirasvoista ja histosykleistä. Kuten MPA: n tapauksessa, peroksidaasireaktiota käytetään suorissa ja epäsuorissa versioissa.

Suora immunoperoksidaasireaktio. Tunnettuna komponenttina käytetään peroksidaasileimattuja vasta-aineita kaikkia patogeenisiä mikro-organismeja vastaan. Valmiste, esimerkiksi sormenjälkilevyt, kiinnitetään jäähdytetyllä asetonilla (-15 - 20 ° C), kuivataan, 4 - 5 tippaa konjugaattia lisätään työtiitteriin (leimatut vasta-aineet), inkuboidaan kosteassa kammiossa 37 ° C: ssa 1,2 tuntia, pestään fysiologisella 15 minuutin liuoksella, huuhdellaan tislatulla vedellä, kuivataan, valmisteeseen lisätään useita tippoja substraattiliuosta (25 mg 3,3-DAB • 4HC1 liuotetaan 100 ml: aan 0,05 M Tris-puskuria, jonka pH on 7,5, ja 25 ml tätä liuosta yhdistetään 3 ml 0,5% vetyperoksidiliuosta). Valmistetta substraatin kanssa pidetään 5,10 minuuttia, pestään fysiologisella suolaliuoksella 10 minuutin ajan, huuhdellaan tislatulla vedellä ja mikroskooppisesti.

Jos haluttua mikrobiantigeeniä on läsnä testimateriaalissa, peroksidaasileimatut vasta-aineet sitoutuvat siihen spesifisesti. Substraatin lisääminen peroksidaasiin johtaa värillisen tuotteen muodostumiseen, joka on näkyvissä mikroskopialla, ensin sinisinä rakeina ja myöhemmin kellanruskeana.

Epäsuora immunoperoksidaasireaktio. Kuten MFA: issa, myös peroksidaasileimattuja vasta-aineita käytetään tietyn eläinlajin immunoglobudiineihin. Ensimmäisessä vaiheessa valmistetta, jossa testimateriaali on kiinnitetty jäähdytetyllä asetonilla, käsitellään kosteassa kammiossa 37,38 ° C: n lämpötilassa. 1,2 osaa immuuniseerumia (0,2. 0,3 ml), joka sisältää leimaamattomia vasta-aineita halutulle antigeenille. Sitten valmistetta pestään fysiologisella suolaliuoksella 5 minuutin ajan, kuivataan ja käsitellään lämpötilassa 37 ° C. 38 ° C: ssa 1. 6 tuntia kostutetussa kammiossa vasta-aineilla, jotka on merkitty peroksidaasilla (konjugaatti työlaimennoksessa). Myöhemmät operaatiot ja tulosten kirjaaminen ovat samanlaisia ​​kuin peroksidaasireaktion suora variantti.

Kiinteän faasin ELISA. Levitä laajimmin. Tässä tapauksessa vasta-aineet tai antigeenit kiinnitetään liukenemattomiin kantajiin: mikropaneeleihin, lasi- tai nylon-palloihin.

Eri reaktiovarianttien tulokset otetaan huomioon instrumentaalisesti tai visuaalisesti.

Sandwich-antigeenin havaitseminen koostuu seuraavista vaiheista.

Polystyreenimikropaneelien kuopat herkistetään vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä halutulle antigeenille [2] pitoisuutena 10,30 μg / ml. Tyypillisesti 0,2 ml vasta-aineliuosta lisätään kuoppaan puskurissa, jonka pH on 9,6, pidetään 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan ja jätetään sitten yön yli 4 ° C: seen. Paneelimmunoglobuliinien liuos poistetaan ja pestään PBS: llä (pH 7,4) kolme kertaa. ylimääräisten vapaiden (adsorboitumattomien) vasta-aineiden poistamiseksi.

0,2 ml liuosta, joka sisältää testiantigeeniä, lisätään kuoppiin ja inkuboidaan 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan, sitten paneelit pestään uudelleen, kuten aiemmin on kuvattu.

0,2 ml entsyymileimattuja spesifisiä vasta-aineita (konjugaatti) lisätään kuoppiin; paneeleja inkuboidaan 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan, sitten ne pestään sitoutumattomilta vasta-aineilta.

0,2 ml entsyymisubstraattiliuosta [ortofenyleenidiamiini (CRF) tai

5-aminosalisyylihappo - peroksidaasille ja p-nitrofenyylifosfaatti - alkaliselle fosfataasille] ja inkuboitu pimeässä 20 ° C: ssa..

Reaktio pysäytetään lisäämällä 0,05 ml 2 N. rikkihappoliuos (peroksidaasille) ja 3 M natriumhydroksidiliuos (alkaliselle fosfataasille).

Tulosten laskenta on visuaalista tai spektrofotometristä absorption lisäämiseksi 490 nm (peroksidaasi) tai 405 nm (alkalinen fosfataasi) aallonpituudella. Aine OFD: positiivinen tulos - oranssi-ruskea värjäys. 5-aminosalisyylihapposubstraatti: positiivinen tulos - voimakas ruskea.

Positiivisen tuloksen saavuttamiseksi ota koe-näytteiden ylimääräinen optinen tiheys kontrollin yli viisi-kuusi kertaa.

Vasta-aineiden havaitseminen (veren seerumissa) perustuu samaan periaatteeseen, mutta kiinteän faasin kantaja herkistetään tunnetulla antigeenillä, käsitellään testiseerumilla, sitten lajien vastaisella immunoglobuliinilla, joka on merkitty entsyymillä. Substraatti lisätään ja värireaktiota käytetään arvioimaan vasta-aineiden läsnäoloa tai puuttumista testiseerumissa..

RIIPPUMATTÖÖN TEHTÄVÄT

1. Tunnista luomistaudin ja salmonelloosin suoran MFA: n patogeenien viljelmä.

2. Tunnista Salmonellan kaksivaiheinen MFA-viljelmä.

3. Tutkimaan mikroskooppista kuvaa ottaen huomioon histokemiallisen ELISA-tutkimuksen (immunoperoksidaasikoe) tulokset.

1. Mikä on yksivaiheisen, kaksivaiheisen ja kolmivaiheisen MFA: n ydin??

Mikä on parempi ja tehokkaampi laboratoriodiagnostiikassa - PCR tai ELISA?

PCR ja ELISA ovat kaksi diagnoosimenetelmää, jotka ovat ansainneet tunnustusta lääketieteen ammattilaisten keskuudessa. Molemmat tutkimukset molekyylin biokemian luokasta ovat tarkkoja ja luotettavia. PCR: n tai ELISA: n välillä on ero, mikä kuvaa patologioita paremmin ja totuudenmukaisemmin? Kysymykseen vastaamiseksi kannattaa ymmärtää menetelmien ydin, tunnistaa diagnostisten menetelmien yhtäläisyydet ja erot.

Mikä on PCR??

PCR on erittäin herkkä polymeraasiketjureaktio, joka havaitsee taudin aiheuttajan (virukset, bakteerit, klamydia) kehossa. Tekniikka perustuu infektiossa läsnä olevan DNA: n spesifisen rakenteen määrittämiseen. PCR suoritetaan epäilyttävän piilevän kroonisen tartuntaprosessin aikana kehossa, joka on piilevässä muodossa. PCR: n ominaisuuksia ja etuja ovat:

  • korkea 100% herkkyys minkä tahansa tyyppisille patogeeneille ainutlaatuisten nukleiinihappofragmenttien läsnä ollessa,
  • tuloksen saamisen nopeus,
  • kyky määrittää yhden tyyppisen patogeenin lukumäärä,
  • useiden patogeenien samanaikainen diagnosointi.

Laboratorioassistentit määrittävät helposti yksittäisen patogeenin DNA-rakenteen käyttämällä polymeraasiketjureaktiota, jonka avulla voidaan seurata ja arvioida hoidon tuloksia lääkehoidon määräämisen jälkeen. PCR on uusi tutkimusmenetelmä välttämätön tällaisten sairauksien diagnosoinnissa:

  • tuberkuloosi,
  • kurkkumätä,
  • salmonelloosi,
  • HIV,
  • aids,
  • riippumaton vaihe C-hepatiitti,
  • bakterioosia.

PCR: n tarkkuus tekniikkana saavuttaa 99% tunnistamalla patogeenit kehon vaurion alkuvaiheessa, jos potilailla ei ole erityisiä oireita. Tämä varmistaa sairauksien nopean paranemisen, saavuttaen joissain tapauksissa kestävän paranemisen..

Mikä on IFA?

ELISA on immuunitutkimusmenetelmä ja tarkka analyysi tarttuvien patogeenien aiheuttamien kehon patologioiden tunnistamiseksi. Tutkimus määrätään epäillyille:

  • kuppa,
  • hepatiitti B, C,
  • klamydia,
  • toksoplasmoosi,
  • sytomegalovirus,
  • herpesvirus,
  • ureaplasmosis,
  • naisten mykoplasmoosi.

Immunofer voi havaita onkologian varhaisessa vaiheessa. ELISAa määrätään hormonien tason havaitsemiseksi veressä, endokriinisten sairauksien diagnosoimiseksi havaitsemalla kasvainmarkerit. Entsyymi-immunomäärityksellä on monia etuja:

  • suorittamisen yksinkertaisuus ja nopeus,
  • korkea herkkyys antigeeni-vasta-ainereaktioissa jopa taudinaiheuttajan alhaisen pitoisuuden taustalla kehossa,
  • korkea analyysi -spesifisyys, jonka avulla voit nopeasti tunnistaa ja perustaa antigeeni-vasta-ainekompleksin, käytetty entsyymi toimii merkinnällä, joka pystyy tarkasti vangitsemaan vuorovaikutussignaalin, tunnistamaan immunoglobuliinit (igm, igg-vasta-aineet) veressä.

Alkuvaiheessa olevan kehon tartunnan tapauksessa luokan M immunoglobuliinit ovat vallitsevia. Infektion edetessä luokan A vasta-aineet kiinnittyvät. Jos sairaus etenee pitkälle, luokan G immunoglobuliinin tuotanto alkaa. Immunoglobuliinin entsyymireaktio paljastaa taudin vakavuuden ja patologian kehitysvaiheen..

Mitä eroa on ELISA: n ja PCR: n välillä??

PCR- ja immunomääritys (ELISA) -analyysit ovat yhtä kysyttyjä diagnostisiin tarkoituksiin. Molemmilla tutkimuksilla on etuja ja haittoja, yhtäläisyyksiä ja eroja..

  1. JOS. Pääsuunta on merkkiaineproteiinien jätetuotteiden havaitseminen tai yhteyksien luominen taudinaiheuttajan ja immuunijärjestelmän välille. Infektion leviämisen kumoaminen tai vahvistaminen elimissä. ELISA: n ja PCR: n välinen ero on minkä tahansa biomateriaalin soveltuvuus analyyseihin: kudosnäyte, sylki, virtsa, veri.
  2. PCR: n avulla voit tunnistaa spesifisen patogeenin, joka kuuluu sienten, virusten ja bakteerien ryhmään. Polymeraasidiagnostiikkamenetelmä havaitsee patogeenisen organismin testimateriaalissa: neste, kudos, elin. Saadakseen laaja-alaisen kuvan kehon sisällä tapahtuvista patologisista prosesseista, lääkärit määräävät heti 2 tyyppistä analyysiä kompleksissa. Tämä on tärkeää sukupuolitautien havaitsemiseksi (yhdynnän kautta levinneet patologiat).

Sukupuoliteitse tarttuvan tartuntataudin ja veressä olevien vasta-aineiden pitoisuuden määrittämiseksi tarkasti suoritetaan ensin PCR, koska ELISA-tutkimuksen tuloksia ei voida kohtuudella käyttää perustana hankkimatta perustietoja.

Kun vasta-aineita havaitaan kehossa, yhtä ELISA: ta ei voida yksiselitteisesti sanoa: eteneekö kehon patologinen prosessi vai ei. Ehkä yhteydet taudinaiheuttajaan olivat, mutta menneisyydessä, ja analyysi voi antaa väärän tuloksen.

On mahdotonta tehdä yksiselitteisiä johtopäätöksiä PCR: stä tai ELISA: sta ja siitä, mikä on oikeastaan ​​luotettavampi. ELISA on tehokas diagnoosimenetelmä, mutta sairauden todennäköisyys voidaan vahvistaa vain PCR: llä, joten on kohtuullista suorittaa molemmat tutkimukset yhdessä. PCR on tarkempi tutkimusmenetelmä, mutta kudosmateriaalinäytteessä ja erillisessä kehon alueella. Metodologian tarkkuudesta huolimatta virheitä esiintyy usein, koska tarttuva prosessi voi levitä nopeasti koko kehoon.

Etenemisen seuraaminen, esimerkiksi: klamydia kohdunkaulakanavaa pitkin, on vaikeaa. Infektiota ei välttämättä ole munasarjoissa ja munuaisissa, jos ELISA-testi on positiivinen ja PCR-testi negatiivinen. Se tapahtuu päinvastoin. 100%: n tuloksen saamiseksi molemmat PCR- ja ELISA-testit tehdään parhaiten yhdessä..

Se tapahtuu, että PCR: n tai ELISA: n tulokset eivät ole samat, mikä tapahtuu pitkäaikaisen kroonisen infektion tai kehon tottuessa sen vaikutukseen. Tässä tapauksessa ELISA on negatiivinen ja PCR on positiivinen. Jos leviämässä on vähän mikrobia, mutta vasta-aineita muodostuu ja tiitterit pysyvät veressä pitkään myös hoitojakson jälkeen, ELISA on positiivinen ja PCR-negatiivinen.

Usein menetelmät antavat vääriä positiivisia vääriä vastauksia, kun esimerkiksi: ELISA on positiivinen, PCR on positiivinen. Potilaiden oireet otetaan huomioon, jos heitä on hoidettu infektioiden varalta. Tapahtuu, että PCR on negatiivinen ja ELISA on negatiivinen.

Eri kliiniset tapaukset vaativat yksilöllistä lähestymistapaa. Siksi mikä analyysi on parempi suorittaa ja tarkemmin: PCR tai ELISA - päätöksen tekee hoitava lääkäri.

On suositeltavaa tarkistaa piilevät sukupuolitaudit ja tehdä testit kumppanin kanssa. Loppujen lopuksi käy niin, että toisella on selvä tulehduksellisen prosessin kulku, ja toisella ei ole edes epäilyjä, mikä vaikuttaa kielteisesti seksuaalielämään ja aiheuttaa epäluottamusta. Aina on parempi kuulla lääkäriä ja saada hoitoa molemmat kumppanit hoitokuurin tehokkuuden lisäämiseksi ja hoidon keston lyhentämiseksi.

Esimerkiksi: ureaplasmoosilla ja mykoplasmoosilla voidaan saavuttaa hyviä tuloksia lantion tulehduksellisten prosessien hoidosta vain, jos suoritetaan yhteinen hoitokuuri.

Ominaisuudet huomioon ottaen voidaan päätellä, että PCR-diagnostiikka ja ELISA ovat erilaisia, mutta molemmat menetelmät voivat luotettavasti määrittää patologioiden esiintymisen. Vain asiantuntijat voivat kuitenkin tunnistaa menetelmien välisen eron, valita todelliset ja oikeat diagnoosimenetelmät, antaa tarkemmin saatujen analyysitulosten dekoodauksen.

Lisätietoja PCR-menetelmästä videosta:

Julkaisuja Sydämen Rytmin

Lasten sukupuolen laskeminen veren uusimista varten

Lapsen syntymä on luultavasti silmiinpistävin tapahtuma miehen ja naisen elämässä. Jopa ensimmäisten raskauskuukausien ajan jokainen heistä on niin kiinnostunut tietää, kuka heidän lapsensa on: poika vai tyttö syntyy?

Tärkeä kysymys: mitkä viljat ovat parempia diabeteksen suhteen

Manka Kaikkein tyhjinä pidetään mannasuuripuurona. Monet rakastavat häntä ja pitävät häntä lapsuuden siivuina. Mutta biologisen arvotason mukaan manna on luettelon viimeinen.